一、模擬灌裝試驗指南征求稿

　　最近網(wǎng)上流傳SFDA查驗中心2016年7月發(fā)布了《無(wú)菌制劑培養基模擬灌裝試驗指南》（征求意見(jiàn)稿），大致內容概述如下：

　　1、目的：充分評價(jià)藥品生產(chǎn)企業(yè)的無(wú)菌操作水平。

　　2、適用范圍：采用無(wú)菌生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的無(wú)菌制劑。

　　3、定義：模擬無(wú)菌操作全過(guò)程，以評價(jià)無(wú)菌保證水平。

　　4、原則：模擬試驗的前提是GMP合規；首次或變更后需要對無(wú)菌生產(chǎn)過(guò)程風(fēng)險點(diǎn)進(jìn)行事先評估，評估結果在試驗方案設計中予以考慮；關(guān)注開(kāi)放操作、人工干預等高風(fēng)險過(guò)程；多產(chǎn)品多規格和顯著(zhù)差異的無(wú)菌工藝過(guò)程逐一開(kāi)展模擬試驗。

　　5、模擬范圍：從第一步無(wú)菌操作開(kāi)始，直至無(wú)菌產(chǎn)品完全密封結束。

　　6、方案設計及實(shí)施過(guò)程：

　　6.1前提條件是，廠(chǎng)房設施、文件、人員更衣及培訓、密封性驗證等均已完成；

　　6.2方案設計，應重點(diǎn)評估無(wú)菌操作的高風(fēng)險過(guò)程，重點(diǎn)考察有人員參與的關(guān)健操作，證實(shí)無(wú)菌操作人員滿(mǎn)足無(wú)菌生產(chǎn)要求。

　　6.3培養基：一般選廣譜的胰酪胨大豆肉湯培養基（TSB），厭氧產(chǎn)品可用硫乙醇酸鹽液體培養基（FTM），如為動(dòng)物來(lái)源培養基，需提供無(wú)BSE（可傳染性海綿腦?。?TSE（瘋牛?。┳C明，也可先植物來(lái)源的培養基。

　　6.3.1培養基促生長(cháng)能力試驗，包括白色念珠菌（CMCC98001）、黑曲霉（CMCC98003）、枯草芽孢桿菌（CMCC63501）、金黃色葡萄球菌（CMCC26003）、銅綠假單胞菌（CMCC10104）、生孢梭菌（CMCC64941）六種標準菌株，還應考慮加入環(huán)境和無(wú)菌檢查中發(fā)現的微生物，且接種量應控制在10CFU-100CFU/灌裝單位，5天的促生長(cháng)試驗，應證明培養基能夠支持微生物的生長(cháng)。

　　6.3.2培養基配制：應按照培養基生產(chǎn)商提供的配方配制培養基，并考慮降低非無(wú)菌培養基中細菌和霉菌生長(cháng)的風(fēng)險，以避免微生物生長(cháng)導致培養基過(guò)濾性能降低。

　　6.3.3培養基的除菌與滅菌：除菌過(guò)濾，其可靠性是通過(guò)專(zhuān)門(mén)的除菌過(guò)濾挑戰實(shí)驗驗證的，無(wú)法通過(guò)培養基模擬灌裝試驗的結果證實(shí)。濕熱滅菌，要避免過(guò)度滅菌，可采用濕熱滅菌與除菌過(guò)濾聯(lián)合使用的方式，但都應進(jìn)行促生長(cháng)性能檢查。輻照滅菌，可避免支原體污染風(fēng)險，常與除菌過(guò)濾聯(lián)合使用。

　　6.4灌裝量：灌裝量通常應能達到容器體積的1/3～1/2，即可保證產(chǎn)品通過(guò)倒置和旋轉接觸到所有內表面并有足夠的氧氣支持微生物的生長(cháng)，以利于對培養基的觀(guān)察。企業(yè)應基于風(fēng)險評估的原則對所設計的灌裝數量、持續時(shí)間、模擬方式、預期收率作出合理說(shuō)明。對大規模生產(chǎn)，即產(chǎn)品的生產(chǎn)批量大于10000支，最低模擬灌裝數量應不低于10000支，且不應低于產(chǎn)品實(shí)際生產(chǎn)批量的10%。

　　6.5最差條件的選擇（關(guān)鍵點(diǎn)）：應基于風(fēng)險等級并結合無(wú)菌生產(chǎn)工藝、設備裝備水平、人員數量和干預等因素來(lái)設計模擬試驗最差條件。值得注意的是最差條件并不是指人為創(chuàng )造的超出允許范圍的生產(chǎn)狀況和環(huán)境，比如故意做AB級停電的無(wú)菌挑戰是不能接受的。包括人員：應包括日常參與到無(wú)菌生產(chǎn)的全部人員，如生產(chǎn)操作、取樣、環(huán)境監測和設備設施維護人員，同時(shí)應考慮以上人員交叉作業(yè)、班次輪換、更衣、夜班疲勞狀態(tài)等因素。工藝時(shí)間：應適當考慮模擬實(shí)際生產(chǎn)操作過(guò)程中房間、設備、物料消毒或滅菌后放置的最長(cháng)時(shí)間及最長(cháng)的工藝保留時(shí)限等。灌裝速度：采用最慢的灌裝速度、最大的容器用以模擬最長(cháng)暴露時(shí)間，也可采用最快的灌裝速度、最小的容器用以模擬最大操作強度/難度。環(huán)境：模擬試驗挑戰的最差環(huán)境應考慮選擇單批產(chǎn)品無(wú)菌生產(chǎn)周期末端、間歇式生產(chǎn)的空調系統重新開(kāi)啟后或連續生產(chǎn)期間周期性滅菌最長(cháng)的時(shí)間間隔。

　　6.6接下來(lái)是“干預”：干預可分為固有的干預和糾正性干預。固有干預是指常規和有計劃的無(wú)菌操作，如裝載膠塞，環(huán)境監控，設備安裝等；糾正性干預則是指對無(wú)菌生產(chǎn)過(guò)程的糾正或調整，如生產(chǎn)過(guò)程中清除破碎的瓶子，排除卡住的膠塞，更換部件、設備故障排除等。

　　6.7容器規格與容器閉封組合：一般選擇應對最小和最大尺寸的容器進(jìn)行培養基灌裝模擬試驗，通常采用透明的容器代替不透明或棕色的容器，以保證識別受污染模擬產(chǎn)品的能力。

　　6.8培養前的容器檢查：模擬試驗中完整性缺陷產(chǎn)品的剔除工藝應采用日常生產(chǎn)的剔除工藝，除完整性缺陷的產(chǎn)品外，其他外觀(guān)缺陷、灌裝量異常的模擬產(chǎn)品也應進(jìn)行培養并用于評估污染率。

　　6.9培養條件：培養前，應對模擬灌裝產(chǎn)品進(jìn)行顛倒、輕搖以使培養基接觸所有內表面。培養時(shí)間至少14天，一般采用先在20-25℃最少培養7天，然后在30-35℃的范圍繼續培養7天。也可采用單一的20-35℃的培養條件，但應有相關(guān)的數據證明培養條件有利于微生物的生長(cháng)。

　　6.10培養后的檢查：應對所有模擬灌裝產(chǎn)品逐支進(jìn)行無(wú)菌性檢查，在培養期間定期觀(guān)察培養基的培養情況，如在培養期間發(fā)現陽(yáng)性樣品，應做標記并立即移出培養箱（室）。

　　6.11計數與數額平衡：對各個(gè)階段的模擬灌裝產(chǎn)品進(jìn)行準確計數：包括灌裝、培養前檢查、培養后檢查的數量等。

　　6.12環(huán)境及監控：采樣人員無(wú)菌操作能力及環(huán)境監測對無(wú)菌灌裝的影響都應在培養基模擬灌裝試驗中充分評估。

　　6.13人員因素：所有被授權在生產(chǎn)時(shí)進(jìn)入無(wú)菌灌裝間的人員，包括觀(guān)察人員和維修人員，每年至少參加一次成功的培養基模擬灌裝試驗，方可參與正常生產(chǎn)的無(wú)菌操作，應保留人員參與相關(guān)模擬試驗的記錄。

　　6.14方案的實(shí)施：模擬試驗的結果、評估和結論應形成書(shū)面報告并經(jīng)質(zhì)量管理部門(mén)批準，根據實(shí)施記錄，為通過(guò)模擬驗證的人員頒發(fā)確認書(shū)并規定有效期限。

　　7、可接受標準與結果判斷：培養基模擬灌裝試驗可接受標準應當遵循現行GMP無(wú)菌附錄中的有關(guān)規定。應基于風(fēng)險評估的原則制定科學(xué)合理的內控限度；出現任何陽(yáng)性均應進(jìn)行徹底、規范的調查；在科學(xué)評估的基礎上采取適當的糾偏措施。如果連續進(jìn)行的模擬灌裝批中反復出現陽(yáng)性意味著(zhù)無(wú)菌生產(chǎn)工藝存在系統性問(wèn)題，必須得到有效解決。

　　8、污染調查及糾正措施：

　　8.1不管批量有多大，只要無(wú)菌工藝驗證存在污染，意味著(zhù)無(wú)菌保證可能存在問(wèn)題，發(fā)現任何污染樣品均應進(jìn)行調查，應利用一切可能的方法調查污染的來(lái)源，污染調查流程及方法應在方案中明確規定。模擬灌裝中出現任何數量的污染都必須視為偏差并徹底調查。分離到的污染微生物應鑒別到種屬，鑒別結果應與本次試驗過(guò)程所有微生物檢測結果及企業(yè)微生物菌種庫進(jìn)行對比，為查找污染途徑提供可能的依據。調查的關(guān)鍵是找到污染的來(lái)源，結合調查需要，必要時(shí)應制定完整的取樣和微生物鑒別計劃，調查過(guò)程應有記錄并歸檔。

　　8.2如調查找到指定的原因，應制定糾正預防措施，并再次進(jìn)行模擬試驗，以證明措施的有效性。如調查無(wú)指定原因，應對生產(chǎn)工藝過(guò)程的無(wú)菌控制開(kāi)展系統性評估，同時(shí)應適當增加試驗批次。

　　8.3調查結果應形成書(shū)面報告并得到質(zhì)量管理部門(mén)的批準。

　　9、試驗周期及再驗證：

　　9.1新建無(wú)菌生產(chǎn)線(xiàn)，在正式投產(chǎn)之前，每班次應當連續進(jìn)行3次合格試驗，在無(wú)菌生產(chǎn)工藝中一條生產(chǎn)線(xiàn)存在多臺相同功能設備時(shí)，應進(jìn)行風(fēng)險評估決定相關(guān)驗證次數，但每臺設備應至少進(jìn)行一次模擬試驗。

　　9.2正常生產(chǎn)期間應當按照生產(chǎn)工藝每條生產(chǎn)線(xiàn)每班次每半年進(jìn)行一次，每次至少一批。對于設備因其它原因停產(chǎn)一定周期的生產(chǎn)線(xiàn)，在恢復正式生產(chǎn)前應考慮進(jìn)行培養基模擬灌裝試驗

　　9.3空氣凈化系統、生產(chǎn)用設備、無(wú)菌生產(chǎn)工藝及人員重大變更或設備的重大維修后，應當進(jìn)行培養基模擬灌裝試驗。

　　9.4企業(yè)應充分評估生產(chǎn)線(xiàn)的風(fēng)險，在發(fā)現設施、人員、環(huán)境或工藝的持續監測出現不良趨勢或無(wú)菌不合格時(shí)，也應考慮再次進(jìn)行模擬試驗。

　　二、模擬灌裝試驗的實(shí)例

　　列舉一個(gè)廠(chǎng)凍干針劑例子，方案介紹如下：

　　1、標題：XXX凍干粉針劑生產(chǎn)線(xiàn)培養基模擬灌裝試驗驗證方案

　　2、簽批：生產(chǎn)起草，由技術(shù)、檢驗、驗證、QA等部門(mén)審核，最終QP批準。

　　3、修訂歷史記錄：版本、修訂日期、修訂/更改要求的原因、修訂人等。

　　4、目錄：有20個(gè)項目，列有內容標題和頁(yè)碼。

　　5、正文

　　5.1目的：

　　根據GMP規范要求和廠(chǎng)驗證主計劃要求，特擬定本方案，對該生產(chǎn)線(xiàn)的無(wú)菌生產(chǎn)工藝進(jìn)行再驗證，通過(guò)此次驗證確保該凍干劑生產(chǎn)線(xiàn)無(wú)菌保證水平。

　　本方案盡量使用與實(shí)際生產(chǎn)工藝相同的條件和操作方法，同時(shí)模擬最差灌裝工況，向注射劑瓶?jì)裙嘌b經(jīng)除菌過(guò)濾器過(guò)濾的胰酪胨大豆肉湯培養基（TSBmedium），然后半壓塞、模擬凍干、壓塞、軋蓋；將此制品在適當條件下培養檢查其受微生物污染的程度，以確認無(wú)菌生產(chǎn)工藝過(guò)程的可靠性，并確認所采用的各種方法和規程防止微生物污染的水平能達到可接受的合格標準。

　　通過(guò)模擬灌裝試驗確認以下可能導致產(chǎn)品微生物污染的工況對產(chǎn)品無(wú)菌性的影響：

　　1灌裝間的潔凈環(huán)境

　　2灌裝過(guò)程中直接與產(chǎn)品接觸的器具及物料的使用前的儲存時(shí)間

　　3在RABS層流保護下，膠塞、瓶子暴露4小時(shí)后的無(wú)菌性

　　4無(wú)菌生產(chǎn)潔凈區操作人員數量及無(wú)菌操作技能

　　5灌裝過(guò)程持續的時(shí)間

　　6灌裝人員的交接班過(guò)程

　　7操作人員通過(guò)RABS手套對灌裝、軋蓋過(guò)程進(jìn)行干擾的次數和時(shí)間（未打開(kāi)門(mén)）

　　8操作人員打開(kāi)RABS門(mén)對灌裝、軋蓋過(guò)程進(jìn)行干擾的次數和時(shí)間（打開(kāi)門(mén)）

　　9環(huán)境監測和取樣過(guò)程

　　10使用無(wú)菌風(fēng)險最高的板層模擬培養基凍干操作

　　11灌裝過(guò)程中設備故障的維修過(guò)程

　　12凍干機滅菌后最長(cháng)使用時(shí)間

　　13出箱持續時(shí)間

　　14軋蓋持續時(shí)間

　　5.2概述：其中工藝描述包括批量、產(chǎn)品包裝形式、包裝組件規格、生產(chǎn)線(xiàn)速度（模擬灌裝的高、中、低速）、洗瓶、配料、灌裝、凍干、軋蓋的工藝過(guò)程描述；相對上次是否發(fā)生變更及風(fēng)險評估。畫(huà)出凍干粉針劑的生產(chǎn)線(xiàn)工藝流程圖。

　　5.3參考文件：如SFDA的藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規范--無(wú)菌附錄（2010年）、藥品GMP指南--無(wú)菌藥品（2010年）、藥品生產(chǎn)驗證指南（2003版）、EU的GuidetoGoodManufacturingPracticeforMedicinalProducts（01版）、USA的ValidationofPharmaceuticalProcesses（3rdEdition,319-326）、PDA的TechnicalReportNo.22rocessSimulationTestingforAsepticallyFilledProducts（1996,50,S1）。

　　5.4縮寫(xiě)與定義：PQ、PV、QA、QP、CGMP等。

　　5.5職責：生產(chǎn)、技術(shù)、質(zhì)量控制、質(zhì)量保證等在本培養基模擬灌裝試驗中的分工和職責。如質(zhì)量管理負責人職責為最終批準驗證過(guò)程中的偏差或變更；最終批準所有驗證方案；

　　最終批準所有驗證總結報告。

　　5.6實(shí)施和文件要求：按《驗證實(shí)施和記錄標準操作程序》實(shí)施本項驗證，收集和記錄相關(guān)信息和驗證結果。實(shí)施過(guò)程中如出現偏差或變更，或出現需要對方案進(jìn)行修訂的情況，填寫(xiě)“偏差表格”或“驗證方案修訂申請表”，并在“驗證方案修訂記錄表”中記錄本項驗證實(shí)施過(guò)程中發(fā)生的所有方案修訂。

　　5.7培訓確認/簽名表：記錄所有實(shí)施本方案相關(guān)工作的人員，確認所有人員在方案實(shí)施前均已接受適宜的培訓。所有實(shí)施本方案的人員，均須針對本方案和相應方法及相關(guān)SOP進(jìn)行培訓，以正確實(shí)施和記錄相關(guān)工作。在實(shí)施方案前，在下表中登記姓名、部門(mén)名稱(chēng)，并簽名和簽署日期。

　　5.8驗證前確認：一是文件：模擬灌裝涉及的操作均有規程指導，包括名稱(chēng)，編號，版本號，生效日期等，確認實(shí)施前已生效。二是物料：如胰酪胨大豆肉湯培養基、瓶子、膠塞、鋁蓋、過(guò)濾器，六種標準菌株白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌。三是設備和設施系統驗證情況確認：如空氣凈化系統、氣、汽系統、滅菌和除菌系統驗證、主要生產(chǎn)設備驗證。

　　5.9培養基性能試驗

　　5.9.1培養基無(wú)菌性能試驗：取模擬灌裝過(guò)程中經(jīng)第二道除菌過(guò)濾器過(guò)濾后初期的培養基溶液100g和灌裝結束后分液器及針頭殘留溶液用潔凈容器收集100g，送至潔凈室的超凈臺，將培養基以5ml/支的裝量裝入各20支已滅菌的試管中，各用作培養基無(wú)菌性能試驗樣品。（注意過(guò)濾初期的培養基不得廢棄）。培養管先在20-25℃條件下培養7天，再在30-35℃條件下培養7天，觀(guān)察菌落生長(cháng)情況。培養14天后無(wú)微生物生長(cháng)才算通過(guò)。

　　5.9.2培養基微生物生長(cháng)性能試驗：取模擬灌裝過(guò)程中經(jīng)第二道除菌過(guò)濾器過(guò)濾后初期的培養基溶液100g，送至潔凈室的超凈臺，將培養基以5ml/支的裝量裝入20支已滅菌的試管中，用作培養基生長(cháng)性能試驗樣品。取10支每管裝量為5ml胰酪胨大豆肉湯培養基樣品，分別接種菌液濃度為100-1000CFU/ml的菌懸液0.1ml的銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌各3支，另取1支不接種作為空白對照，30-35℃培養3天；取7支每管裝量為5ml胰酪胨大豆肉湯培養基樣品，分別接種菌液濃度為100-1000CFU/ml的菌懸液0.1ml的白色念珠菌、黑曲霉菌液各3支，另取1支不接種作為空白對照，20-25℃培養5天。判斷標準是空白對照管應無(wú)菌生長(cháng)，加菌的培養基管內菌落均生長(cháng)良好且菌落形態(tài)與所加菌種相符，則該培養基可使用，否則換用其他培養基。

　　5.10模擬灌裝安排

　　一是生產(chǎn)安排，確定灌裝批量，灌裝時(shí)使用多少ml注射劑瓶及相應膠塞，每瓶樣品灌裝多少量的培養基溶液，灌裝培養基樣品分別裝載在凍干機的哪些板層，培養基灌裝的持續時(shí)間至少達到多少小時(shí)。灌裝機按規定速度進(jìn)行培養基灌裝。模擬整條生產(chǎn)線(xiàn)正常生產(chǎn)過(guò)程中的所有活動(dòng)。

　　二是關(guān)鍵功能操作間同時(shí)容納最多人數的確定，如軋蓋間、清洗間、滅菌間、稱(chēng)量間、工衣清洗干燥間、洗烘瓶、消毒劑配制、灌裝、凍干前室、配料間等各安排多少人。

　　三是最差工況的確定，我列幾個(gè)主要的如下：

　　1、灌裝間的人員在灌裝期間至少2小時(shí)內達到房間額定的最大人數（如9人），其他時(shí)間（吃飯時(shí)間除外）不少于4個(gè)人（實(shí)際灌裝操作需4人）。

　　2、滅菌后注射劑瓶、膠塞敞口暴露或暴露在RABS內的時(shí)間達到或超過(guò)工藝規定最大時(shí)間。

　　3、配制開(kāi)始至第一道過(guò)濾結束持續時(shí)間，模擬工藝規定最長(cháng)間隔時(shí)間。

　　4、模擬灌裝用膠塞、鋁蓋盡量滅菌后存儲大于72小時(shí)后再用于灌裝。

　　5、灌裝機和進(jìn)出料系統需打開(kāi)RABS門(mén)的干擾事件。如需打開(kāi)RABS門(mén)處理的倒瓶、炸瓶（需開(kāi)門(mén)和不開(kāi)門(mén)處理的炸瓶事件均包括在內）、需打開(kāi)門(mén)處理的膠塞堵塞，需打開(kāi)門(mén)處理的灌裝機裝量調整、培養碟放置更換、需打開(kāi)門(mén)處理的灌裝針頭排汽泡、需要打開(kāi)門(mén)抽查裝量及可見(jiàn)異物。

　　6、模擬使用無(wú)菌風(fēng)險最差的板層進(jìn)行裝載產(chǎn)品進(jìn)行模擬凍干。

　　7、軋蓋機和進(jìn)出料系統需要打開(kāi)RABS門(mén)處理的干擾事件。如需打開(kāi)RABS門(mén)處理的鋁蓋震蕩斗卡堵、軋蓋工位卡瓶、反瓶、卡蓋、炸瓶、停機。

　　8、灌裝機出現故障，維修人員進(jìn)入灌裝間維修。如模擬灌裝機運行不正常，打開(kāi)操作屏處電控柜柜門(mén)，檢查線(xiàn)路、元件后，關(guān)上電控柜柜門(mén)，每次維修時(shí)間約30-60分鐘。

　　9、每批灌裝持續時(shí)間不少于實(shí)際操作多少個(gè)小時(shí)。

　　10、凍干機滅菌后最長(cháng)使用周期。工藝允許在相同產(chǎn)品連續生產(chǎn)過(guò)程中，凍干機滅菌后的最長(cháng)使用周期為第N天開(kāi)始使用，間隔時(shí)間為N-1天。

　　5.11模擬程序

　　一是人員、環(huán)境、物料監控。按照日常監測方法對各區域的人員、空氣系統進(jìn)行監測，并將監測數據相關(guān)文件作為附件附在激素凍干粉針生產(chǎn)線(xiàn)模擬無(wú)菌灌裝試驗驗證報告中。特別是模擬灌裝過(guò)程對進(jìn)入B級區的所有操作人員均需進(jìn)行監控，主要操作人員每次進(jìn)入B級區的人員離開(kāi)退出時(shí)，頭、口罩、胸部、肩部、手指、手肘、膝蓋對其取樣進(jìn)行表面微生物監控。

　　二是注射劑瓶、膠塞和鋁蓋處理。記錄試驗用膠塞及鋁蓋滅菌結束時(shí)間，試驗用膠塞及鋁蓋的領(lǐng)用時(shí)間，并計算二者間隔，試驗需要膠塞及鋁蓋滅菌后儲存至少72小時(shí)方可用于模擬灌裝使用。

　　三是注射劑瓶、膠塞無(wú)菌檢查。模擬灌裝試驗過(guò)程中，取部分已滅菌膠塞、已除熱原注射劑瓶敞口暴露于A(yíng)級區域，記錄放置起始時(shí)間、放置結束時(shí)間，計算時(shí)間間隔，同時(shí)分別將部分模擬灌裝結束后的物料進(jìn)行無(wú)菌檢查，其余物料用于正常模擬灌裝并區別，檢查結果記錄于“滅菌后膠塞、除熱原后劑瓶敞口放置時(shí)間檢查表”中。

　　四是灌裝器具滅菌處理。模擬灌裝試驗過(guò)程中，記錄灌裝用具滅菌結束時(shí)間，開(kāi)始使用時(shí)間；記錄并計算相應的時(shí)間間隔，由于過(guò)程模擬時(shí)間較長(cháng)，且前期均做過(guò)相關(guān)確認，故模擬灌裝過(guò)程中每年至少模擬一次。

　　五是凍干機滅菌處理。模擬灌裝試驗過(guò)程中，記錄凍干機滅菌日期至模擬灌裝生產(chǎn)時(shí)使用日期；并計算相應的時(shí)間間隔，由于過(guò)程模擬時(shí)間較長(cháng)，且前期均做過(guò)相關(guān)確認，故模擬灌裝過(guò)程中每年至少模擬一次。

　　六是培養基的配制及處理。

　　l按每批如2萬(wàn)瓶以上瓶產(chǎn)品的模擬灌裝量，計算配制量。

　　l通過(guò)無(wú)菌氮氣壓濾將培養基溶液經(jīng)第一道除菌過(guò)濾器過(guò)濾至無(wú)菌存儲罐。培養基溶液第一道過(guò)濾結束至第二道過(guò)濾開(kāi)始間隔時(shí)間在N小時(shí)以?xún)取?/p>

　　l通過(guò)無(wú)菌氮氣壓濾，將培養基從無(wú)菌儲存罐經(jīng)第二道過(guò)濾器過(guò)濾后送至灌裝機上的緩沖罐，進(jìn)行灌裝操作，當灌裝瓶數可以分別裝滿(mǎn)兩個(gè)凍干箱各一個(gè)板層即約N瓶時(shí)，停止對無(wú)菌儲存罐和緩沖罐內剩余培養基溶液的灌裝。這一階段中所有正常生產(chǎn)過(guò)程中的操作，如取樣、過(guò)濾器完整性試驗等也按實(shí)際生產(chǎn)進(jìn)行模擬。

　　l在灌裝開(kāi)始前取經(jīng)第二道除菌過(guò)濾器過(guò)濾后灌裝開(kāi)始前的培養基溶液約100g，用于培養基無(wú)菌性能試驗，并計算物料平衡。

　　l藥液從配制開(kāi)始到第一道過(guò)濾結束間隔時(shí)間驗證：按照《配料系統操作規程》使用配料系統配制胰酪胨大豆肉湯培養基溶液。稱(chēng)量Ng胰酪胨大豆肉湯培養基在NL的桶中初步溶解后，再倒入混合罐中加水定容至Nkg攪拌混合均勻，模擬中間體檢驗結果等待，從配制開(kāi)始即培養基開(kāi)始溶解至第一道過(guò)濾結束應不少于4小時(shí)。模擬回收配料第二道跨接管剩余培養基，經(jīng)兩道過(guò)濾后進(jìn)行灌裝，回收后灌裝產(chǎn)品與其他產(chǎn)品一起培養。

　　l將培養基溶液配制及藥液模擬回收時(shí)間記入“配制開(kāi)始到第一道過(guò)濾結束間隔時(shí)間驗證記錄表”中。

　　七是無(wú)菌灌裝

　　l培養基模擬灌裝批生產(chǎn)的灌裝間人員：在生產(chǎn)結束人員將退出B級區時(shí)做微生物接觸碟取樣，通過(guò)表面微生物監測結果和培養基模擬試驗的最終結果，確認可進(jìn)行無(wú)菌生產(chǎn)的操作人員資質(zhì)，沒(méi)有按照要求參加培養基灌裝的人員不能直接參與實(shí)際生產(chǎn)。

　　l灌裝班人員交接班工況：模擬灌裝試驗過(guò)程中，模擬灌裝班人員換班操作2次，記錄每次換班時(shí)間及人員，每批兩次，其中進(jìn)、出≥2次。檢查結果記錄于“灌裝班人員交接班記錄表”中。

　　l模擬灌裝過(guò)程安排：按灌裝操作程序，將膠塞加入料斗內，注射劑瓶進(jìn)入灌裝機，過(guò)濾后培養基溶液送至灌裝機上緩沖罐后，啟動(dòng)灌裝機進(jìn)行灌裝進(jìn)箱、模擬凍干、軋蓋；軋蓋后樣品輸送至目檢工序進(jìn)行目檢。培養基第二道過(guò)濾開(kāi)始至進(jìn)料結束持續時(shí)間不小于N小時(shí)（包括交接班換班吃飯時(shí)間，模擬維修時(shí)間，空轉時(shí)間）。灌裝過(guò)程所有的正常操作如稱(chēng)重、檢查、取樣等都應模擬進(jìn)行，灌裝過(guò)程模擬檢查可見(jiàn)異物和裝量差異的樣品，樣品需無(wú)菌壓塞后再模擬檢查，檢查結束后的樣品，若無(wú)破裂和損壞，則均應隨模擬灌裝產(chǎn)品一起進(jìn)行培養，同時(shí)做好標記。

　　l打開(kāi)/不打開(kāi)RABS干擾事件工況：模擬灌裝試驗過(guò)程中，根據日常生產(chǎn)實(shí)際所發(fā)生的情況及次數，模擬灌裝、軋蓋RABS開(kāi)門(mén)/不開(kāi)門(mén)發(fā)生的干擾事件，并實(shí)時(shí)記錄干擾事件發(fā)生時(shí)間及類(lèi)型，檢查結果記錄于“打開(kāi)/不打開(kāi)RABS干擾事件統計表”中，干擾事件分別記錄于“灌裝過(guò)程打開(kāi)RABS門(mén)干擾事件A記錄表”“灌裝過(guò)程不開(kāi)RABS門(mén)干擾事件B記錄表”“出箱軋蓋過(guò)程開(kāi)RABS門(mén)干擾事件C記錄表”“出箱軋蓋過(guò)程不開(kāi)RABS門(mén)干擾事件D記錄表”。

　　l灌裝機故障維修工況：模擬灌裝試驗過(guò)程中，模擬灌裝故障維修，如每批模擬灌裝模擬兩次維修，第一次模擬灌裝機瓶子在出料星輪處堵塞，出料星輪離合器過(guò)載，移除堵塞的瓶子，重新將星輪安裝調整至合適的位置，維修時(shí)間約40分鐘；第二次模擬灌裝機運行不正常，打開(kāi)灌裝機機臺下維修柜門(mén)，檢查線(xiàn)路、部件后，關(guān)上維修柜門(mén)，維修時(shí)間約30分鐘。

　　l灌裝時(shí)間確認：工藝規程規定每批產(chǎn)品灌裝從第二道除菌過(guò)濾開(kāi)始至灌裝結束時(shí)間應≤N小時(shí)。在模擬灌裝試驗過(guò)程中，記錄模擬灌裝從第二道除菌過(guò)濾開(kāi)始至灌裝結束時(shí)間，檢查結果記錄于“灌裝時(shí)間記錄表”中。

　　l凍干操作：按照以下程序模擬樣品在凍干箱內的狀態(tài)：灌裝制品N℃進(jìn)箱，冷凍制品→放置樣品的隔板溫度均降至約N℃→冷阱溫度降至-N℃以下→凍干箱抽真空約Nmbar→打開(kāi)放氣閥放氣→加熱隔板→隔板溫度升至N℃→凍干箱抽真空約Nmbar→全壓塞→打開(kāi)放氣閥放氣→樣品出箱。

　　l出箱、軋蓋：出箱后凍干箱的樣品需收集，每個(gè)收集樣品的中轉盤(pán)上需標明收集序號。收集軋蓋后的樣品，目檢后培養時(shí)將樣品一半正立放置、一半倒立放置。記錄記錄出箱、軋蓋開(kāi)始到出箱、軋蓋結束時(shí)間，確認出箱、軋蓋持續時(shí)間不少于12小時(shí)。

　　5.12模擬灌裝樣品檢查

　　一是灌裝制品培養前檢查：

　　l灌裝制品經(jīng)軋蓋后，包裝班人員在軋蓋出瓶軌道末端按順序接受樣品，并裝入中轉盤(pán)中，每個(gè)中轉盤(pán)上標記樣品接收序號。

　　由包裝目檢人員目檢瓶身破損及鋁蓋、膠塞密封等缺陷情況，若有缺陷品，則剔除缺陷品并記錄缺陷數量及缺陷原因。

　　目檢挑出的空瓶、破瓶、無(wú)塞中間產(chǎn)品作銷(xiāo)毀處理；

　　目檢挑出的松蓋、皺蓋、淺蓋、色點(diǎn)、裝量差異不合格中間產(chǎn)品在鋁蓋頂部標記并登記，按原順序放置于中轉筐或盤(pán)中與正常產(chǎn)品同樣條件下培養，培養結束后檢查；

　　若目檢發(fā)現渾濁樣品，則記錄樣品的盤(pán)號及其在盤(pán)中的順序號，與正常產(chǎn)品同樣條件下培養，培養周期結束后，送微生物室鑒別。

　　l目檢時(shí)上下顛倒振搖，保證培養基溶液與整個(gè)玻璃瓶和膠塞的內表面充分接觸后，將灌裝制品按不同批號區分，按順序裝入不銹鋼盤(pán)或中轉筐。

　　二是灌裝制品的培養及檢查：

　　l培養：將灌裝制品按不同批號區分，同一批號不同板層的灌裝制品也需分開(kāi)放置（小批號樣品一半正立放置、一半倒立放置），裝入中轉筐中，先置20-25℃培養7天，進(jìn)行目檢，將正立轉成倒立，將倒立轉成正立，將再置30-35℃培養7天；記錄培養的起止時(shí)間，且灌裝制品培養期間每?jì)蓚€(gè)小時(shí)至少記錄一次培養溫度至制品結束培養。在房間培養培養基樣品，房間四個(gè)角和中央處均放置一個(gè)溫度計，到達記錄時(shí)間點(diǎn)后記錄同一個(gè)房間內每個(gè)溫度計顯示的溫度。將樣品的培養觀(guān)察結果記錄試驗批樣品培養觀(guān)察記錄”中。

　　l檢查：樣品在20～25℃下培養的7天、30～35℃培養的7天后，至少在第7天，第14天，由經(jīng)過(guò)QC微生物檢驗資質(zhì)人員的培訓的目檢人員（同時(shí)應當有QC現場(chǎng)指導）對培養后的制品的微生物生長(cháng)情況進(jìn)行檢查，并由QA人員對檢驗結果進(jìn)行復核，若發(fā)現有被微生物污染的制品，應記錄瓶數、中間產(chǎn)品批號，并對菌種進(jìn)行鑒別。

　　l陽(yáng)性對照：在模擬灌裝的樣品培養14天結束后，每批隨機抽取培養基樣品N瓶（抽取的樣品需兼顧到每個(gè)板層的樣品），壓緊膠塞，送樣至檢驗室。檢驗室人員對樣品隨機分成五組，每組12瓶，每組分別接種銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、生孢梭菌，接種量均為每瓶0.1ml濃度為100~1000cfu/ml的菌，然后進(jìn)行培養。接種銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的樣品在30-35℃培養3天，接種白色念珠菌、黑曲霉、生孢梭菌的產(chǎn)品在20-25℃培養5天。

　　5.13模擬灌裝物料平衡

　　l灌裝后培養基樣品丟棄記錄：

　　整個(gè)培養基灌裝過(guò)程中需要嚴格控制丟棄任何已經(jīng)灌裝的培養基,任何丟棄都要有充分的理由,并做好相應的記錄和解釋?zhuān)灰献畹凸嘌b量，就不應該丟棄。但如果是膠塞上位不正確的培養基，由于密閉系統不完整，必須進(jìn)行丟棄。將灌裝、軋蓋、目檢、培養過(guò)程中分灌裝后培養基的丟棄記錄記入“灌裝后培養基樣品丟棄記錄表中。

　　l物料平衡計算：

　　配灌工序中間產(chǎn)品物料平衡；自動(dòng)進(jìn)出料、凍干、軋蓋工序中間產(chǎn)品物料平衡；目檢工序中間產(chǎn)品物料平衡。

　　5.14驗證標準及結果評定

　　一是驗證標準。培養基模擬灌裝應以不長(cháng)菌為目標，并遵循以下規則：

　　l當灌裝數少于5000單位時(shí)，不得檢出污染；

　　l當灌裝數在5000-10000單位之間：

　　·出現一個(gè)污染單位，應進(jìn)行調查，包括考慮重新進(jìn)行培養基灌裝；

　　·出現兩個(gè)污染單位，應在調查后進(jìn)行再驗證。

　　l當灌裝數在10000單位以上：

　　§出現一個(gè)污染單位應進(jìn)行調查；

　　§出現兩個(gè)污染單位，應在調查后進(jìn)行再驗證。

　　二是結果評定：結果均應達到不長(cháng)菌的目標，任何一次超過(guò)規定，且長(cháng)菌的樣品不是因為容器的破損造成的，則驗證無(wú)效，應查明污染產(chǎn)生的原因，方可判斷此灌裝工藝過(guò)程符合無(wú)菌灌裝要求。

　　5.15驗證周期

　　l培養基模擬灌裝試驗每半年進(jìn)行一次；

　　l生產(chǎn)工藝變更、重要技術(shù)參數改變時(shí)、班次數有重要的變更后或關(guān)鍵設備更換、大修、變更安裝位置等，須根據評估結果重新進(jìn)行再驗證。

　　5.16驗證計劃實(shí)施情況確認

　　5.17工藝驗證合格標準總結

　　審核該已實(shí)施的培養基模擬灌裝試驗，并確認所有的標準均已達到。如果方案有任何未完成項目，請說(shuō)明。

　　5.18方案修改

　　按驗證實(shí)施和記錄標準操作程序，在驗證實(shí)施過(guò)程中如出現需要對方案進(jìn)行修訂的情況，填寫(xiě)“驗證方案修訂申請表”，并在“驗證方案修訂記錄表”中記錄本項驗證實(shí)施過(guò)程中所作的每一項方案修訂。

　　5.19方案偏差

　　按驗證實(shí)施和記錄標準操作程序，在驗證實(shí)施過(guò)程中如出現偏差或變更，填寫(xiě)“偏差表格”對偏差進(jìn)行調查和處理。

　　5.20附錄

　　將所有驗證方案適用的數據和資料附在附件內。當添加資料/數據到附錄部分時(shí)，請按表填寫(xiě)，并注明附錄中的頁(yè)數，若添加頁(yè)沒(méi)有編頁(yè)碼的，手動(dòng)添加。

　　三、模擬灌裝試驗的問(wèn)題討論（共八個(gè)問(wèn)題）

　　1、2015版中國藥典需氧菌和真菌無(wú)菌檢查改為胰酪胨大豆肉湯培養基（TSB），模擬灌裝試驗的培養基要改嗎？

　　答：不需要改。一般選廣譜的胰酪胨大豆肉湯培養基（TSB），真菌、細菌都能長(cháng)。如果以往產(chǎn)品有過(guò)厭氧成長(cháng)，可以用硫乙醇酸鹽液體培養基（FTM）模擬，同樣條件去做模擬灌裝試驗，厭氧培養基一般會(huì )分層，上層用于隔絕下層的空氣層導致厭氧菌在上層不長(cháng)。厭氧菌要長(cháng)也是在下層，但因有些瓶子不大，如2ml或5ml瓶子無(wú)法造出隔絕空氣層，因模擬陽(yáng)性菌瓶也是不長(cháng)的，所以，既使有厭氧菌也難以存活，故大多企業(yè)是沒(méi)有做厭氧培養基的模擬灌裝試驗。

　　2、指南征求稿中關(guān)于培養時(shí)間至少14天，一般采用先在20-25℃最少培養7天，然后在30-35℃的范圍繼續培養7天。也可采用單一的20-35℃的培養條件，但應有相關(guān)的數據證明培養條件有利于微生物的生長(cháng)。一是能否先30-35℃后20-25℃培養？二是采用單一的20-35℃培養怎么操作？

　　答：第一個(gè)問(wèn)題：就是先低溫真菌培養、再高溫細菌培養，因擔心有些低溫菌先高溫30-35℃培養會(huì )被殺死。另外，真菌相對細菌生長(cháng)得慢，所以先培養真菌7天，后面還有7天的時(shí)間可繼續長(cháng)。而細菌生長(cháng)得快，一般3天就能看出大致，所以可以后培養。

　　第二個(gè)問(wèn)題：培養基灌裝的培養溫度，可以在做完培養基的促成長(cháng)試驗后，選擇一個(gè)20-35℃的溫度進(jìn)行培養，但培養箱的溫度要控制在正負2.5℃。

　　3、什么是培養基模擬灌裝試驗的“最差條件”？（轉摘自醫藥微學(xué)堂，文章由四川蜀陽(yáng)周珍字提供）

　　答：2010版藥品GMP指南：在培養基灌裝設計中，工藝條件的選擇應選取合理的“最差條件”，用最差條件來(lái)對工藝流程、設備和整個(gè)體系進(jìn)行挑戰。如果在最差條件下能獲得好結果，說(shuō)明在比最差情況要好的實(shí)際生產(chǎn)中，無(wú)菌保證的可靠性更有保證。“最差條件”考慮如下三個(gè)方面：

　　一是設施、設備、包材和輔料清潔、滅菌后存放時(shí)間：

　　二是灌裝人員及參數設定：

　　三是干擾項目的設計：

　　模擬實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中出現的各種類(lèi)型的常規性干擾和非常規性干擾。在每半年的培養基灌裝前應對上一階段的生產(chǎn)狀況進(jìn)行總結和趨勢分析，綜合考慮有代表性的活動(dòng)及干預，將其干擾類(lèi)型與頻次列入方案中。從人、機、料、法、環(huán)、測各方面綜合考慮，組合出最具有代表的“最差條件”。

　　4、人員重大變更，是否需要進(jìn)行培養基模擬灌裝試驗才能正式上崗？

　　答：無(wú)菌藥品附錄中第47條：培養基模擬灌裝試驗的首次驗證，每班次應當連續進(jìn)行3次合格試驗?？諝鈨艋到y、設備、生產(chǎn)工藝及人員重大變更后，應當重復進(jìn)行培養基模擬灌裝試驗。培養基模擬灌裝試驗通常應當按照生產(chǎn)工藝每班次半年進(jìn)行1次，每次至少一批。人員重大變更，肯定需要重新進(jìn)行培養基模擬灌裝試驗，只有參加過(guò)模擬灌裝試驗的人員，才可以進(jìn)入到核心灌裝區進(jìn)行正常產(chǎn)品生產(chǎn)的操作。

　　5、在培養基模擬灌裝結束后，在培養時(shí)，是否所有的西林瓶都要倒置培養，還是只需要部分的倒置培養即可？

　　答：只要培養基與西林瓶所有接觸面接觸過(guò)就可以，無(wú)論正立、倒立或平放。行內有三種做法：一是培養基模擬灌裝結束，正常的培養，不需要倒置，培養基培養期間，瓶子里的任何表面都要被培養基接觸到，翻轉幾次就可以了；二是將培養液與西林瓶和膠塞充分接觸，然后一半倒立培養、一半正立培養；三是將培養液與西林瓶和膠塞充分接觸，在20-25度正立培養7天，30-35度倒立培養7天。指南征求稿中是第一種，就是培養前，對模擬灌裝產(chǎn)品進(jìn)行顛倒、輕搖以使培養基接觸所有內表面，再正立培養，開(kāi)始培養后不應再進(jìn)行反轉等干擾。我們是第二種和第三種的混合，如先將灌裝制品按不同批號區分，同一批號不同板層的灌裝制品也需分開(kāi)放置（小批號樣品一半正立放置、一半倒立放置），裝入中轉筐中，先置20-25℃培養7天，進(jìn)行目檢，將正立轉成倒立，將倒立轉成正立，將再置30-35℃培養7天。

　　6、如何判斷哪些灌裝樣品不需要進(jìn)行培養？

　　答：包括破損，影響到密封性的樣品；完整性測試（泄漏測試）失敗的樣品；文件中明確規定予以丟棄的中控測試樣品；設備自動(dòng)剔除的樣品；文件中明確規定，每次干擾后應予手工剔除的樣品（規定應詳細、明確，并需證明其可操作性和穩定可信性）。另外，剔除的樣品應進(jìn)行記錄注明丟棄原因。

　　7、在培養基灌裝試驗中，是否必須進(jìn)行錄像？錄像的保存期需要多長(cháng)？

　　答：不是必需的，錄像僅是一種可選的輔助調查和培訓手段。如果采用了錄像措施，也僅作為公司內部的資料（如同內部審計報告），不必向檢查員出示。公司應有文件規定，什么情況下要進(jìn)行錄像，錄像的儲存時(shí)間等。

　　8、是否可在培養基模擬灌裝試驗中模擬停電的狀況？

　　答：不允許。停電后，核心灌裝區的AB級無(wú)法保證無(wú)菌性，如果可以模擬，還要A級監測相關(guān)指標做什么？一旦A級沒(méi)電，沒(méi)有層流保護，無(wú)菌狀態(tài)被破壞了，即使你無(wú)菌檢測是合格的，畢竟檢測只是僅有代表性，有其無(wú)菌檢測局限性。不能以培養基模擬灌裝試驗中模擬停電為產(chǎn)品放行為借口，可考慮A級有UPS或22S內迅速轉供電也是可以的。