校正因子如何測定？耐用性如何考察？影響因素有哪些？本文借助印度NatcoPharma制藥公司的一篇文章，抽提了其中的一些關(guān)鍵點(diǎn)和代表性圖譜去回答這些問(wèn)題，為藥物分析人員提供了解決思路，能夠降低研發(fā)風(fēng)險。

　　這篇文章通過(guò)改變HPLC色譜條件的參數來(lái)研究相對響應因子（RelativeResponseFactor，RRF）/校正因子（CorrectionFactor，CF）的影響因素，考察因素包括：不同色譜柱、流速、pH值、柱溫、緩沖液濃度、檢測波長(cháng)、不同檢測器（UV和PDA）、不同溶劑級別等。結果表明某些色譜參數的改變可引起結果巨大變化，提示在HPLC方法開(kāi)發(fā)和方法驗證中應注意考慮的問(wèn)題。

　　1.前言

　　相對響應因子（RRF）是一個(gè)與藥物中雜質(zhì)相關(guān)的重要參數，用來(lái)校正雜質(zhì)對主成分峰的響應差異。RRF通常通過(guò)標準曲線(xiàn)法測定。

　　不同藥典對于RRF的要求不同。USP的RRF是指等量的雜質(zhì)和藥物的響應值的比值，將RRF稱(chēng)為相對響應因子（RelativeResponseFactor，RRF）。EP/BP通常稱(chēng)為校正因子（CorrectionFactor，CF）。EP/BP的校正因子是USP相對響應因子的倒數。

　　當對照品不穩定性、想降低雜質(zhì)制備成本、雜質(zhì)的合成或分離難度很大、以及為了節約檢測時(shí)間或提高效率時(shí)，往往需要測定并建立雜質(zhì)RRF值。RRF值可用于不同階段：如1-4期臨床階段，藥物純度測試、質(zhì)量平衡測試、雜質(zhì)測試、穩定性指示方法研究等。

　　2.相對響應因子的測定

　　標準曲線(xiàn)法

　　在測定RRF值之前，先測定空白溶劑、分離度溶液、對照溶液，系統適用性應符合要求。

　　方法1

　　配制至少7份單個(gè)主成分和單個(gè)雜質(zhì)溶液，濃度為供試品濃度的0.1％-1.0％（例如0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.7％、0.8％和1.0％），或配制至少3個(gè)點(diǎn)低于限度（高于LOQ）3個(gè)點(diǎn)高于限度7份單個(gè)主成分和單個(gè)雜質(zhì)溶液。

　　在同一色譜條件下測定。

　　方法2

　　配制至少7份單個(gè)主成分和所有雜質(zhì)混合溶液（如果雜質(zhì)間不相互干擾，可進(jìn)雜質(zhì)混合溶液），濃度為供試品濃度的0.1％-1.0％（例如0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.7％、0.8％和1.0％），或配制至少3個(gè)點(diǎn)低于限度（高于LOQ）3個(gè)點(diǎn)高于限度共7份單個(gè)主成分和所有雜質(zhì)混合溶液。

　　在同一色譜條件下測定。

　　方法3

　　配制至少7份主成分和所有雜質(zhì)的混合溶液（如果所有峰不相互干擾，可進(jìn)主成分、雜質(zhì)的全混合溶液），濃度為供試品濃度的0.1％-1.0％（例如0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.7％、0.8％和1.0％），或配制至少3個(gè)點(diǎn)低于限度（高于LOQ）3個(gè)點(diǎn)高于限度共7份主成分和所有雜質(zhì)的混合溶液。

　　在同一色譜條件下測定。

　　繪制主成分濃度對峰面積的標準曲線(xiàn)圖，不包含“零”點(diǎn)。

　　繪制雜質(zhì)濃度對峰面積的標準曲線(xiàn)圖。

　　所有數據點(diǎn)使用最小二乘法列出線(xiàn)性回歸方程

　　即y=mx+c

　　確定每個(gè)線(xiàn)性回歸方程的斜率。

　　主成分和雜質(zhì)的相關(guān)系數均應不小于0.995。

　　有用的計算公式

　　公式1：

　　主成分或雜質(zhì)的濃度=重量（mg）/稀釋?zhuān)╩L）×（游離堿的分子量/鹽的分子量）×純度

　　公式2：

　　主成分或雜質(zhì)的濃度=重量（mg）/稀釋?zhuān)╩L）×純度

　　公式3：

　　雜質(zhì)的相對響應因子=雜質(zhì)的斜率/主成分的斜率

　?。ㄗ⒁猓河嬎銜r(shí)，如果雜質(zhì)的斜率為分子，則計算出的相對響應因子值在用于計算藥物中的雜質(zhì)含量時(shí)，應出現在分母中，即除以該值）。

　　公式4：

　　雜質(zhì)的校正因子=主成分的斜率/雜質(zhì)的斜率

　?。ㄗ⒁猓河嬎銜r(shí)，如果雜質(zhì)的斜率為分母，則計算出的校正因子值在用于計算藥物中的雜質(zhì)含量時(shí)，應出現在分子中，即乘以該值）。

　　注意事項

　　1根據雜質(zhì)或主成分對照品使用說(shuō)明書(shū)規定確定含量及雜質(zhì)或主成分存在形式，必要時(shí)進(jìn)行折算。

　　2當采用其他實(shí)驗室（除藥典對照品外）的對照品時(shí)，宜測定LC-MS、色譜純度、TGA等。

　　3如果雜質(zhì)為定量測定，應在原料或制劑的雜質(zhì)限度附近（低于、相當、高于）測定RRF。

　　4RRF值應經(jīng)過(guò)二次確認。

　　影響RRF值的因素（文獻報道）

　　[1]色譜柱的變化（同種型號來(lái)自不同色譜柱制造商）

　　[2]色譜柱粒徑的變化

　　[3]檢測波長(cháng)的變化

　　[4]檢測器的變化

　　[5]溶劑級別的變化

　　[6]緩沖液濃度的變化

　　[7]柱溫的變化

　　[8]流速的變化

　　[9]pH值的變化

　　基本信息

　　甲磺酸伊馬替尼是一種抗腫瘤藥物，分子式為C29H31N7O·CH3SO3H，分子量為589.7。

　　甲磺酸伊馬替尼片中含有兩種已知雜質(zhì)，即雜質(zhì)F（去甲基雜質(zhì)）和雜質(zhì)G（異構體）。甲磺酸伊馬替尼、雜質(zhì)G、F的結構式和光譜圖見(jiàn)圖1-3。

　　試驗準備

　　1儀器

　　Waters高效液相色譜儀（泵為2487，檢測器為2695，工作站為Empower2）

　　色譜柱：WatersX-BridgeC18，250x4.6mm,5μm

　　微量天平：MettlerToledo，XP6

　　分析天平：MettlerToledo，AB204S

　　pH計：LabIndia，Pico+

　　2試劑

　　水、三乙胺、磷酸二氫鈉均為HPLC級；乙腈、甲醇均為梯度級；甲磺酸伊馬替尼、雜質(zhì)G、雜質(zhì)F工作對照品由NatcoPharmaLimited，Hyderabad，India公司提供。

　　3溶液配制

　　緩沖液：取3.0g磷酸二氫鈉二水合物，用1000mL水溶解，用三乙胺調節pH值至8.0±0.05

　　混合溶劑：甲醇-乙腈（600:400）

　　流動(dòng)相A：緩沖液-混合溶劑（550：450）

　　流動(dòng)相B：混合溶劑

　　溶劑：流動(dòng)相A

　　雜質(zhì)G和雜質(zhì)F儲備液：精密稱(chēng)取雜質(zhì)G和雜質(zhì)F對照品各5.0mg，置25mL量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。

　　對照品溶液：精密稱(chēng)取甲磺酸伊馬替尼24.0mg，置100mL量瓶，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液1.0mL，置100mL量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻。

　　樣品溶液：精密稱(chēng)取甲磺酸伊馬替尼片細粉適量（相當于伊馬替尼100mg），置100mL量瓶中，加溶劑60mL，超聲處理15分鐘，不時(shí)振搖，放冷至室溫，用溶劑稀釋至刻度，混勻，在3500rpm下離心處理10分鐘，取上清液。

　　4色譜條件及色譜圖

　　色譜柱：X-BridgeC18，250mm×4.6mm，5μm

　　柱溫：30℃

　　流速：1.0mL/min

　　進(jìn)樣量：20μL

　　檢測波長(cháng)：230nm

　　運行時(shí)間：60min

　　伊馬替尼及其雜質(zhì)在此色譜條件下在230nm附近均有較大吸收，混合溶液的色譜圖見(jiàn)圖10，RRT值和RRF值見(jiàn)表2。

　　相對響應因子的測定（分析人員-1）

　　1溶液配制

　　儲備溶液制備（主成分和雜質(zhì)混合物）：精密稱(chēng)取5.002mg甲磺酸伊馬替尼、4.978mg雜質(zhì)F和5.029mg雜質(zhì)G，置100mL量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。

　　對照品和雜質(zhì)的純度和稱(chēng)樣量見(jiàn)表3。

　　從儲備液制備成各濃度溶液（0.02％-1.00％）的過(guò)程及線(xiàn)性范圍試驗結果見(jiàn)表4-6。

　　雜質(zhì)F和G相對響應因子的計算（分析人員-1）

　　[1]甲磺酸伊馬替尼儲備液的制備：

　　儲備液制備=（5.002/100）（99.0/100）（493.6/589.7）1000=41.45ppm

　　稀釋溶液=儲備溶液（ppm）×取樣體積（mL）/稀釋至體積（mL）

　　注：折算系數為493.6/589.7，493.6為伊馬替尼的分子量，589.7為甲磺酸伊馬替尼的分子量。

　　[2]雜質(zhì)F儲備液的制備：

　　儲備液制備=（4.978/100）×（94.8/100）×1000=47.19ppm

　　稀釋溶液=儲備溶液（ppm）×取樣體積（mL）/稀釋至體積（mL）

　　[3]雜質(zhì)G儲備液的制備：

　　儲備液制備=（5.029/100）×（92.3/100）×1000=46.42ppm

　　稀釋溶液=儲備溶液（ppm）×取樣體積（mL）/稀釋至體積（mL）

　　[4]雜質(zhì)RRF的計算：

　　公式=已知雜質(zhì)的斜率/主成分的斜率

　　雜質(zhì)F的RRF=雜質(zhì)F的斜率/伊馬替尼的斜率=61754.05/74167.65=0.83

　　雜質(zhì)G的RRF=雜質(zhì)G的斜率/伊馬替尼的斜率=68661.27/74167.65=0.93