從2013年張鋒[1]和GeorgeChurch[2]第一次使用CRISPR-Cas9編輯人體細胞算起，這項技術(shù)在人體細胞中的使用已經(jīng)走過(guò)5個(gè)年頭。

雖然CRISPR被科學(xué)家使用的很溜，并已經(jīng)走到臨床試驗階段；但我們對Cas9的切割原理和切割后細胞修復機制的了解還比較少，甚至可以說(shuō)它們還是個(gè)黑盒子。

前不久，上海交通大學(xué)吳強教授課題組在MolecularCell上發(fā)表了一篇文章，他們發(fā)現Cas9切割DNA雙鏈可以產(chǎn)生突出末端，而不僅僅是平頭末端，這顛覆了我們對Cas9切割的認知[3]。

近日，加州大學(xué)伯克利分校的JacobCorn團隊在Cas9切割后的修復機制上也取得了顛覆認知的重大突破。

總的來(lái)說(shuō)，Corn團隊這次解決了一個(gè)長(cháng)期困擾科學(xué)家的問(wèn)題：用CRISPR-Cas9切斷細胞的DNA之后，細胞究竟是如何選擇用哪種方式修補斷裂的缺口的？

更重要的是，他們的這個(gè)發(fā)現甚至可以讓科學(xué)家以后根據自己的需求，操縱細胞的修復方式，讓細胞基因組DNA在被Cas9切斷后，按照需求去修復缺口。正真實(shí)現精準切割，精準修補。

這對很多需要做基因修復的遺傳疾病而言，無(wú)疑是個(gè)好消息。上周四，Corn團隊的這一重要研究成果發(fā)表在《自然遺傳學(xué)》上[4]。

CRISPR-Cas9只是上帝的手術(shù)刀，修復還是得靠細胞

一直以來(lái)，我們都形象地把CRISPR-Cas9叫做“上帝的手術(shù)刀”，而不把它叫做“上帝的針線(xiàn)包”，主要是因為Cas9只負責精準的切斷DNA，修復的任務(wù)要交給細胞自身。

通常情況下，CRISPR-Cas9切斷DNA形成的雙鏈斷裂后，細胞會(huì )很快啟動(dòng)緊急修復機制。其中最主要的兩條是：非同源末端連接和同源重組。

其中非同源末端連接修復機制被科學(xué)家用的最多，效率也最高。它就是不管三七二十一，盡快把斷裂的DNA連接起來(lái)，維持DNA的穩定。這種修復方式絕大部分情況下會(huì )在切割位點(diǎn)產(chǎn)生隨機插入或缺失，直接導致基因功能喪失。

無(wú)論如何，對細胞而言，損失一個(gè)基因，比掛了肯定好多了。這種修復方式其實(shí)也是細胞的最常見(jiàn)修復方式。鑒于這種修復方式的特點(diǎn)，它被廣泛用于基因功能的研究。

而同源重組修復機制，則是在有同源供體DNA序列的配合下，用一段正確的基因序列替換原本錯誤的基因序列[5]。也就是我們常說(shuō)的：哪里壞了，換哪里?？茖W(xué)家和醫生治療基因變異導致的疾病，依賴(lài)的就是這種修復方式[6]。

目前，同源重組修復過(guò)程中使用的外源DNA模版有兩種：一種是雙鏈DNA，另一種是單鏈DNA模版修復（SSTR）。

CRISPR/Cas9切斷DNA之后的可能修復機制

不過(guò)，大量的研究表明，把雙鏈DNA作為模版修復斷裂的DNA在絕大多數細胞類(lèi)型中是非常低效的[7]。相較而言呢，以單鏈DNA為修復模版的SSTR模式在人類(lèi)細胞中倒是很高效[8]，所以使用的也比較多。

雖然SSTR效率高，但是Corn團隊在不同的人類(lèi)癌細胞系中做研究還是發(fā)現，SSTR的修復效率還是有很大的差異，從完全無(wú)效的0%，到非常高效的30%。這似乎暗示，SSTR是否能完成修復與細胞類(lèi)型有一定的關(guān)聯(lián)。

再仔細一想呢，不同細胞類(lèi)型的基因表達水平實(shí)際上是相差很大的，是不是某些特殊的DNA修復通路的打開(kāi)或關(guān)閉，影響了SSTR修復的效率呢？

如果我們能發(fā)現影響SSTR修復機制的相關(guān)基因，那么在以后的臨床應用中，在編輯基因的同時(shí)，特異性的調節相關(guān)基因的表達水平。那轉化效率就可以大幅提升，治療效果也會(huì )穩步提升啊。

研究人員趕緊去查查相關(guān)資料。

很幸運，SSTR在人體中修復的機制還鮮為人知。如果能解決這個(gè)困擾著(zhù)很多科學(xué)家的問(wèn)題，那么Corn團隊肯定很開(kāi)心。

此處應該再次出現斯托帕德那句話(huà)：“再一次一無(wú)所知，從頭開(kāi)始……這讓我很開(kāi)心。”

聰明的實(shí)驗設計

Corn團隊的研究人員究竟有多開(kāi)心我是沒(méi)辦法知道了。不過(guò)，當我看到他們解決問(wèn)題的思路時(shí)，我何止是很開(kāi)心，簡(jiǎn)直是很興奮，以至于喝了5杯濃茶也沒(méi)驅散的午間睡意，瞬間消散。

他們首先做了一個(gè)假設：既然是DNA斷裂的修復出現了不穩定的問(wèn)題，那問(wèn)題應該就處在細胞內跟DNA修復有關(guān)的基因上；如果在調控那些修復基因表達的同時(shí)，同步開(kāi)展CRISPR-Cas9的剪切，和切斷后的SSTR修復，不就可以通過(guò)二者之間的相互作用找到影響SSTR的關(guān)鍵基因了嗎！

于是，研究人員首先找到了2000多個(gè)跟DNA修復有關(guān)的基因。然后做了一個(gè)非常聰敏的設計。

他們創(chuàng )造性的使用了CRISPRi基因沉默技術(shù)[9]、CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)和熒光標記技術(shù)，創(chuàng )建了一個(gè)可視化的“沉默-編輯”平臺。

首先，他們給所有的細胞加了個(gè)藍色熒光基因，讓這些細胞發(fā)藍光。

所有的細胞都藍瑩瑩的，真好看~

然后，給這些細胞分別裝入用來(lái)沉默修復相關(guān)基因的CRISPRi基因沉默系統。每個(gè)細胞沉默掉一個(gè)修復相關(guān)基因，在一個(gè)有數百萬(wàn)個(gè)細胞的群體中，就產(chǎn)生了2000個(gè)基因分別被沉默掉的細胞庫。

緊接著(zhù)，研究人員就要對那個(gè)藍色熒光蛋白基因下手了。

他們把靶向切割藍色熒光蛋白基因的CRISPR-Cas9編輯系統，以及一個(gè)與藍色熒光蛋白基因有同源臂的綠色熒光蛋白基因的單鏈DNA，一起轉到上面的那個(gè)細胞庫里。

接下里會(huì )發(fā)生什么，你們肯定能想到把，還需要我說(shuō)嗎~

忍不住了，我還是說(shuō)下吧。

理想狀況下（我們只說(shuō)理想狀況下），上面的細胞庫顏色會(huì )發(fā)生如下變化。有些還是藍色，意味著(zhù)基因編輯失??；有一些細胞沒(méi)有顏色了，大概率意味著(zhù)意味著(zhù)Cas9把藍色熒光蛋白基因切斷了，然后細胞按照非同源末端連接的方式又把它隨便連上了，導致基因功能喪失了；剩下的細胞成功變綠了，這些細胞實(shí)現了SSTR修復。

研究人員用流式細胞儀按照顏色，給所有的細胞分分成三撥：有6.8%的細胞還保持這藍色，有67.5%的細胞不顯色了，22.8%的細胞變成了綠色。

加起來(lái)是97.1%，還有2.9%的細胞怎么了？這些細胞出現了理想狀況之外的情況，我們就不管它們了。

未被重視的“交通信號燈”

有了上面的細胞。接下來(lái)的事情就好辦了，用二代測序技術(shù)，分析分析這三個(gè)細胞群體中g(shù)RNA的水平變化，就可以知道哪些基因會(huì )影響SSTR的效率了。

這一分析不要緊，研究人員發(fā)現之前認為與SSTR修復有關(guān)的DNA修復基因，似乎與SSTR關(guān)系并不大。

讓研究人員意外的是，那些處在范科尼貧血（Fanconianemia；FA）的通路上的基因，與SSTR關(guān)系密切。

范科尼貧血是瑞士兒科醫生GuidoFanconi在1927年首次報道的，它是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳性血液系統疾病[10]。1992年報道了4個(gè)可能與FA相關(guān)的基因，到現在已經(jīng)鑒定出了20多個(gè)與FA的發(fā)病有關(guān)的基因變異。

一直以來(lái)，研究人員認為，FA通路上的基因編碼的蛋白與識別和修復基因組中的鏈間交聯(lián)（ICL）有關(guān)。并不認為它與CRISPR-Cas9導致的DNA雙鏈斷裂修復有關(guān)。

這個(gè)發(fā)現，被研究人員視為至寶。

為了進(jìn)一步證實(shí)FADNA修復通路上的蛋白與SSTR修復模式效率之間的關(guān)系。研究人員用CRISPRi分別穩定地敲低了FA路徑中的FANCA，FANCD2，FANCE，FANCF，FANCL，HELQ，UBE2T，USP1和WDR48。發(fā)現SSTR修復模式效率顯著(zhù)下降。

如果在敲低的同時(shí)，用cDNA在細胞內穩定地表達那個(gè)敲低的蛋白，讓它們的表達恢復到野生的水平。研究人員發(fā)現，SSTR修復模式效率提升8倍，回升到正常水平。

這些研究表明，FA通路中的許多基因對SSTR修復模式是必需的。

更有意思的是，研究人員還發(fā)現FA通路只影響SSTR，它不會(huì )促進(jìn)非同源末端連接?？傮w來(lái)說(shuō)，在DNA被切斷之后，細胞修復DNA的首選方式是非同源末端連接，這也是為什么這種修復方式一直比例最高。

而FA通路更像個(gè)“交通信號燈”：在FA通路不活躍的時(shí)候，所有的車(chē)都朝一個(gè)方向（非同源末端連接）開(kāi)；但如果FA通路很活躍，那么它就要指揮其中一部分車(chē)往另一個(gè)方向（SSTR）走。

原來(lái)是這樣！

用論文第一作者ChrisRichardson的話(huà)說(shuō)，就是“FA通路是維持非同源末端連接和SSTR之間平衡的”。

后記

“治療鐮狀細胞貧血，成功的機會(huì )與用正確的基因替代突變的基因效率密不可分，”Richardson這么評價(jià)自己的研究[11]，“如果你從患者那里獲得了100萬(wàn)個(gè)細胞，30%-40%的替換率肯定比10%的好多了。”

現在看來(lái)，Richardson的愿望真的有可能實(shí)現了。

將來(lái)，科學(xué)家可以通過(guò)分析細胞基因的表達水平，提前預知一類(lèi)細胞是否適合SSTR。如果這類(lèi)細胞SSTR效率低，甚至可以考慮臨時(shí)激活FA通路。

無(wú)論如何，科學(xué)家掌握了Cas9切割后的這層修復機制，未來(lái)給患者換個(gè)基因啥的，那簡(jiǎn)直是效率高多了。