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世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬在中國誕生!

摘要:亨廷頓舞蹈癥、阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側索硬化癥等是當今社會(huì )嚴重威脅人類(lèi)健康的神經(jīng)退行性疾病。這些疾病伴隨年齡漸長(cháng)而產(chǎn)生、可遺傳、呈漸進(jìn)性發(fā)展,由于缺乏合適的動(dòng)物模型進(jìn)行藥物篩選,目前尚無(wú)有效的治療方法。

在廣州九龍鎮有一座“豬賓館”,生活著(zhù)一群身嬌肉貴的實(shí)驗小豬,他們能精準地模擬人類(lèi)的疾病??茖W(xué)家利用基因“剪刀”CRISPR-Cas9,精準地把人突變的亨廷頓基因“粘貼(敲入)”到豬的亨廷頓基因中,從而使豬得了亨廷頓舞蹈病。

廣東科學(xué)家領(lǐng)銜的國際研究團隊經(jīng)過(guò)四年努力,首次利用基因編輯技術(shù)(CRISPR/Cas9)和體細胞核移植技術(shù),成功培育出世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬,精準地模擬出人類(lèi)神經(jīng)退行性疾病。
 
實(shí)驗動(dòng)物基地“豬豬賓館”
 
該項成果于北京時(shí)間3月30日在線(xiàn)發(fā)表在生物學(xué)頂尖學(xué)術(shù)期刊《細胞》上,該研究為開(kāi)發(fā)治療亨廷頓舞蹈病的新手段提供了穩定、可靠的動(dòng)物模型,也為培育其它神經(jīng)退行性疾病大動(dòng)物模型提供了技術(shù)范本和理論依據。研究將推動(dòng)我國發(fā)展出大動(dòng)物疾病模型的醫藥研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈,也可用于干細胞治療等手段的臨床前評價(jià),最終造福于人類(lèi)。
 
“近年來(lái),我國在基因編輯猴和克隆猴的研究中相繼取得突破性成果。”中科院院士裴鋼教授在得知該成果發(fā)表后指出,此次我國科學(xué)家在豬的疾病模型研究中又取得重大進(jìn)展,表明我國在大動(dòng)物模型的研究中已走在世界前列,將極大地推動(dòng)我國生物醫藥產(chǎn)業(yè)的創(chuàng )新發(fā)展。
 
該成果由暨南大學(xué)粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院教授李曉江團隊、中科院廣州生物醫藥與健康研究院研究員賴(lài)良學(xué)團隊、美國埃默里大學(xué)教授李世華團隊等多個(gè)研究團隊共同完成,論文共同通訊作者為李曉江、賴(lài)良學(xué)、李世華,論文共同第一作者為暨南大學(xué)粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院副研究員閆森和涂著(zhù)池博士、中科院廣州生物醫藥與健康研究院劉朝明。
 
什么是亨廷頓舞蹈癥
 
亨廷頓舞蹈癥、阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側索硬化癥等是當今社會(huì )嚴重威脅人類(lèi)健康的神經(jīng)退行性疾病。這些疾病伴隨年齡漸長(cháng)而產(chǎn)生、可遺傳、呈漸進(jìn)性發(fā)展,由于缺乏合適的動(dòng)物模型進(jìn)行藥物篩選,目前尚無(wú)有效的治療方法。
 
李曉江介紹,神經(jīng)退行性疾病是致病蛋白變異后沉淀在神經(jīng)細胞中,造成神經(jīng)細胞功能紊亂,并引發(fā)神經(jīng)細胞死亡,從而導致疾病發(fā)生。而亨廷頓舞蹈病是由單基因(HTT)突變導致的神經(jīng)退性疾病。這是一個(gè)理想的疾病模式,可用于研究蛋白質(zhì)錯誤折疊如何引起選擇性的神經(jīng)退性病變,是以后研究多基因突變病癥的基礎。
 
尋找合適的疾病實(shí)驗模型
 
小鼠作為最常見(jiàn)的動(dòng)物模型,已被廣泛地用于研究人類(lèi)疾病機理和尋找臨床治療方法。李曉江團隊在研究中發(fā)現,表達突變基因的神經(jīng)退行性疾病小鼠模型,并不能表現出像病人腦中一樣的典型神經(jīng)細胞死亡的重要病理特征。許多有治療效果的藥物在小鼠模型中有效,在臨床上對病人往往無(wú)效。為了探索動(dòng)物模型,他開(kāi)始把目光轉移到大動(dòng)物、非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物身上。
 
早在2008年,“夫妻檔”科學(xué)家李曉江、李世華在美國Emory大學(xué)合作者的支持下,通過(guò)將外源性的突變基因引入到獼猴的體內,成功地建立了世界首只轉基因亨廷頓病猴模型。李曉江說(shuō),在該模型中,可以明顯地觀(guān)察到相應的病理特征和行為變化,但表達外源性致病基因片段的毒性過(guò)強。實(shí)驗中的轉基因猴子基本在出生后較短時(shí)間內死亡,同時(shí)無(wú)法傳代。因此,轉基因亨廷頓病猴模型無(wú)法達到篩選治療疾病的藥物的目的。
 
為何選擇豬
 
位于廣州九龍鎮的“豬賓館”,記者看到,科學(xué)家們正精心飼養著(zhù)一群身價(jià)不菲的實(shí)驗小豬。與果蠅、線(xiàn)蟲(chóng)、小鼠等小型動(dòng)物相比,豬被公認為是人類(lèi)醫學(xué)研究理想的大動(dòng)物模型。賴(lài)良學(xué)解釋?zhuān)i的心血管系統、消化系統、皮膚、營(yíng)養需要、骨骼發(fā)育以及礦物質(zhì)代謝等都與人的情況極其相似,豬的體型大小和馴服習性允許進(jìn)行反復采樣和進(jìn)行各種外科手術(shù)。
 
賴(lài)良學(xué)提到,與非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物相比,豬的基因多樣、繁殖周期短、一窩產(chǎn)仔多,便于根據特殊需要進(jìn)行選育,又不存在倫理學(xué)方面的問(wèn)題。所以,豬的疾病模型用于做藥物篩選、人類(lèi)疾病研究、干細胞治療的研究結果,更容易轉化為臨床應用。
 
作為華南地區重要的大動(dòng)物疾病模型實(shí)驗平臺之一,賴(lài)良學(xué)團隊先后建立了20余種在生物醫藥和農業(yè)領(lǐng)域具有重要價(jià)值的轉基因和基因打靶克隆豬。2010年,這對“夫妻檔”找到了賴(lài)良學(xué),一拍即合,他們合作建立了首例轉基因亨廷頓病豬模型。
 
“世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬模型,在模擬病人的神經(jīng)病理變化特別是腦疾病方面,大動(dòng)物模型比小動(dòng)物模型更具優(yōu)勢。”賴(lài)良學(xué)接受《中國科學(xué)報》記者采訪(fǎng)時(shí)表示,該研究為開(kāi)發(fā)治療亨廷頓舞蹈病的新手段提供了穩定、可靠的動(dòng)物模型,也為培育其它神經(jīng)退行性疾病大動(dòng)物模型提供了技術(shù)范本和理論依據。
 
大膽的科學(xué)設想
 
擺在科學(xué)家面前的是一個(gè)難題,與轉基因亨廷頓病猴模型一樣,豬模型也具有明顯的表型特征,但不易存活,無(wú)法傳代。這一問(wèn)題,曾一度令他們感到非常困擾。李世華說(shuō),“人是在某個(gè)定點(diǎn)基因突變而導致亨廷頓疾病,而目前轉基因技術(shù)是隨機性的將外來(lái)的變異基因插入動(dòng)物的基因組,其表達量也高于內源性致病基因。”
 
團隊進(jìn)而分析,直接把豬的內源性基因改變?yōu)橥蛔兓?,豬的病理變化應該與病人的病理狀態(tài)更接近。然而,基因敲入的效率太低,在大動(dòng)物中很難獲得。2013年,隨著(zhù)基因編輯技術(shù)(CRISPR/Cas9)被廣泛應用于哺乳動(dòng)物中,在廣東省科技計劃的支持下,他們大膽嘗試這一科學(xué)設想,李世華著(zhù)手應用Cas9技術(shù)來(lái)建立亨廷頓基因敲入豬模型。團隊通力合作,利用基因編輯技術(shù)(CRISPR/Cas9),將人突變的亨廷頓基因插入到豬的內源性亨廷頓基因的表達框中,即人外顯子1中包含150CAG重復序列精確地插入豬的HTT內源性基因中。
 
能夠成功關(guān)鍵還看實(shí)驗進(jìn)展,利用成纖維細胞篩選出陽(yáng)性克隆細胞,這并非一件易事,“單細胞逐個(gè)挑出來(lái)并進(jìn)行篩選及鑒定,一定要挑選狀態(tài)最好的細胞用來(lái)胚胎移植”。負責此項實(shí)驗工作的閆森先后篩選了上千個(gè)細胞,從中挑出確定帶有突變基因且狀態(tài)最好的細胞,閆森說(shuō),“每天早上7點(diǎn)進(jìn)入細胞間,看細胞、換液、不停地跟細胞打交道,一抬頭已是下午3點(diǎn)。好不容易篩選到的陽(yáng)性克隆細胞如果狀態(tài)不好又得重來(lái),只有大量篩選才能獲得最優(yōu)的細胞克隆。很快,實(shí)驗進(jìn)入下一步,他們運用體細胞核移植技術(shù)進(jìn)行克隆,成功培育帶有突變基因的新生豬。
 
在歷經(jīng)5個(gè)月的觀(guān)察后,亨廷頓豬出現了運動(dòng)障礙等漸進(jìn)性發(fā)病的表型。下一步就是將穩定表達的基因敲入亨廷頓豬繁殖下去。由于疾病模型豬身體狀態(tài)不好,在傳代過(guò)程中更需要悉心的照料。終于在團隊的呵護下F1代小豬出生了。為了證明亨廷頓基因敲入豬的病理特征更接近于人類(lèi)。李世華多次從美國返回國內親自指導實(shí)驗,到豬場(chǎng)看小豬的生存環(huán)境及生活狀態(tài)。
 
實(shí)驗結果傳來(lái),他們成功了!其結果驗證,該模型不但能夠模擬亨廷頓病患者在大腦紋狀體的神經(jīng)元選擇性死亡的典型病理特征,在行為上也表現出類(lèi)似亨廷頓病“舞蹈樣”的異常行為。難能可貴的是,這些病理及行為學(xué)表型都可以穩定地遺傳給后代。
 
作為世界首例亨廷頓病豬基因敲入模型,它表明在模擬病人的神經(jīng)病理變化特別是腦疾病方面,大動(dòng)物模型比小動(dòng)物模型更具優(yōu)勢。

為人類(lèi)試藥造福于人類(lèi)
 
神經(jīng)疾病基因敲入豬的成功,將推動(dòng)我國發(fā)展出大動(dòng)物疾病模型的醫藥研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈,促進(jìn)針對阿爾茨海默病、帕金森癥等神經(jīng)退行性疾病,以及免疫缺陷、腫瘤、代謝性疾病的新藥研發(fā)進(jìn)程。同時(shí),該動(dòng)物模型可用于干細胞治療等手段的臨床前評價(jià),最終造福于人類(lèi)。
 
從事多年研究亨廷頓病的權威專(zhuān)家、美國加州大學(xué)洛杉磯分校楊向東(X.WilliamYang)教授指出,亨廷頓舞蹈病基因敲入豬的建立是神經(jīng)退行性疾病研究領(lǐng)域中一個(gè)里程碑式的發(fā)現,使科學(xué)家能更深入了解神經(jīng)細胞死亡的機制及尋找有效的治療方法。
 
文章共同第一作者為暨南大學(xué)粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院閆森副研究員和涂著(zhù)池博士、中國科學(xué)院廣州生物醫藥與健康研究院劉朝明。中山大學(xué)、吉林大學(xué)、云南農業(yè)大學(xué)的科學(xué)家們也參與了該工作。研究工作得到了國家自然科學(xué)基金委、國家重大研究計劃、國家重點(diǎn)研發(fā)計劃以及廣東省科技計劃的大力支持。
 
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