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走進(jìn)細胞培養代謝副產(chǎn)物 - NH4+

摘要:培養基、細胞質(zhì)和線(xiàn)粒體內的氨(NH3)和銨離子(NH4+)之間一直處于一種動(dòng)態(tài)平衡,它們之間的相互轉化受所處環(huán)境的pH影響,NH3和NH4+的動(dòng)態(tài)平衡是調節胞內pH處于穩態(tài)的方式之一。

細胞培養環(huán)境對單抗的產(chǎn)量和質(zhì)量有著(zhù)重大影響,如培養基成分、pH、DO、溫度等,另外對細胞具有毒性的代謝副產(chǎn)物乳酸和銨的累積同樣會(huì )影響細胞表現與抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量。培養基中乳酸的來(lái)源主要為葡萄糖的不完全降解,銨主要來(lái)自于谷氨酰胺的代謝降解和自發(fā)降解,當然其他一些氨基酸或血清成分的代謝也是銨的來(lái)源之一。眾多學(xué)者就銨的機理及對細胞的生長(cháng)、蛋白產(chǎn)量與質(zhì)量的影響均有研究,文中筆者就銨的毒性機理、對細胞及蛋白的影響、降低銨的措施等進(jìn)行簡(jiǎn)要概述。

毒性機理

1.胞內pH平衡
 
培養基、細胞質(zhì)和線(xiàn)粒體內的氨(NH3)和銨離子(NH4+)之間一直處于一種動(dòng)態(tài)平衡,它們之間的相互轉化受所處環(huán)境的pH影響,NH3和NH4+的動(dòng)態(tài)平衡是調節胞內pH處于穩態(tài)的方式之一。NH3是一種不帶電荷、脂溶性的小分子,可通過(guò)自由擴散作用透過(guò)細胞膜,驅動(dòng)力為膜兩側的濃度差;而NH4+的膜穿透速度卻是比較慢的,因為其只能在能量的作用下通過(guò)Na+K+-ATPase、Na+K+2Cl-轉運蛋白等進(jìn)出細胞膜,而且采用這種方式時(shí)NH4+需要與K+等離子競爭轉運蛋白上的結合位點(diǎn),可能會(huì )破壞細胞膜上的離子動(dòng)態(tài)平衡,影響胞內穩態(tài)。
 
一般情況下,外界環(huán)境、細胞質(zhì)和線(xiàn)粒體內的NH3和NH4+處于動(dòng)態(tài)平衡,NH3在膜內外的自由擴散對細胞內的pH進(jìn)行微調,但基本處于一種平衡狀態(tài),如圖1a所示。當向培養基中添加NH4Cl或者由于培養基中谷氨酰胺自發(fā)降解導致的NH4+增加時(shí),如圖1b所示,在濃度梯度作用下NH3進(jìn)入細胞內、線(xiàn)粒內及其他含膜細胞器內,從而使細胞內的pH上升,對酶活造成不利影響,從而會(huì )限制細胞生長(cháng)和代謝。

2.底物代謝循環(huán)
 
NH3和NH4+對細胞的影響還體現在代謝上,銨可以通過(guò)與酶的結合位點(diǎn)相互作用而影響酶活,例如對谷氨酰胺酶和谷氨酰胺合成酶的影響。谷氨酰胺酶催化谷氨酰胺降解形成谷氨酸和銨,谷氨酰胺合成酶使反應向相反的方向進(jìn)行,有研究報道稱(chēng)提高銨濃度可以刺激谷氨酰胺酶的活性,其具體機制還不明確。另外,谷氨酸在谷氨酸脫氫酶作用下的進(jìn)一步降解時(shí)會(huì )產(chǎn)生氨和α-酮戊二酸,此過(guò)程需要NAD+的參與,如圖2所示,同時(shí)氨和α-酮戊二酸合成谷氨酸的反應可以一定地解除銨對細胞的毒性效應。
 
此外,糖代謝的關(guān)鍵酶磷酸果糖激酶(PFK)的活性也受銨影響,高濃度的銨會(huì )擾亂糖代謝途徑,導致乳酸濃度升高。還有研究發(fā)現,銨會(huì )促進(jìn)細胞內UDP-N-乙酰半乳糖胺的合成,雖然作用機理還不明確,但高水平的UDP-N-乙酰半乳糖胺對細胞是具有毒性。由上可知,銨是底物代謝重要的參與者,同時(shí)也可影響部分酶的酶活,細胞培養過(guò)程中銨濃度失調對細胞生長(cháng)的影響細胞是必然的。
 
對細胞及蛋白的影響

1.細胞生長(cháng)及代謝
 
通過(guò)外源性的添加NH4Cl,學(xué)者們就銨濃度增加對細胞的影響進(jìn)行了研究,如圖3所示,Yang等發(fā)現細胞密度隨NH4Cl的增加而降低,與對照相比添加40mM的NH4Cl時(shí)細胞密度降低了56%,而低濃度的NH4Cl(5mM之內)的對細胞的影響較小。
 
同時(shí)研究人員還對葡萄糖和幾種氨基酸的比合成或消耗速率進(jìn)行了測定,如下表所示,銨的添加增加了谷氨酸(glutamate)、丙氨酸(alanine)和甘氨酸(glycine)的合成速率,而加速了對葡萄糖和谷氨酰胺(glutamine)的消耗。銨濃度的提高不僅增加了細胞對能量的需求,還影響了細胞的代謝循環(huán),進(jìn)而影響細胞的正常生長(cháng)。當然由于研究過(guò)程中采用的銨離子濃度往往超過(guò)細胞本身所產(chǎn)生的,并不能排除銨單一的對代謝影響的因素,還可能是胞內pH增加的原因。
 
2.糖基化
 
細胞培養過(guò)程中高濃度的銨還會(huì )影響蛋白的糖基化水平,主要表現為降低糖鏈末端的唾液酸化水平、半乳糖苷化等。蛋白的糖基化過(guò)程發(fā)現在內質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內,有學(xué)者認為銨濃度的增加會(huì )增加膜類(lèi)細胞器內的pH,進(jìn)而降低糖基轉移酶和N-乙酰氨基葡糖轉移酶III/IV的活性;還有學(xué)者認為,銨的添加是通過(guò)擾動(dòng)細胞的底物代謝平衡,而影響蛋白的糖基化水平。
 
Chen等就高濃度銨對CHO細胞糖基化的影響進(jìn)行了研究,其通過(guò)定量PCR(QRT-PCR)技術(shù)對糖基化相關(guān)基因(14個(gè)基因)的擴增數進(jìn)行了分析。將銨壓力下CHO細胞和對照組的基因表達相比,發(fā)現有5種基因的表達對銨敏感,包括:UDP-半乳糖轉運蛋白、β(1,4)-半乳糖基轉移酶、α(2,3)-唾液酸轉移酶、GMP-唾液酸轉運蛋白和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。如圖4所示,與對照相比添加銨的實(shí)驗組α(2,3)-唾液酸轉移酶和GMP-唾液酸轉運蛋白水平較低,這不僅會(huì )導致胞液中唾液酸向高爾基體的轉動(dòng)量降低,還會(huì )影響糖鏈上的唾液酸連接,最終降低蛋白的唾液酸化。
 
數據也顯示,銨濃度增加時(shí),β(1,4)-半乳糖基轉移酶基因的表達量也會(huì )降低,進(jìn)而引起β(1,4)-半乳糖基轉移酶減少,影響半乳糖基化。雖然此時(shí)UDP-半乳糖轉運蛋白的表達會(huì )增加,但從沒(méi)報道過(guò)銨的添加會(huì )增加蛋白半乳糖化,其中的機制還需要更多的研究。而銨濃度對于UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的影響則會(huì )阻礙唾液酸的合成,及其向高爾基體的轉運,從而對唾液酸化產(chǎn)生不利影響。
 
降低銨的策略
 
細胞培養過(guò)程中銨的來(lái)源有兩個(gè)途徑,一是谷氨酰銨(Gln)的自發(fā)化學(xué)降解,二是谷氨酰銨等氨基酸的代謝。為消除由于Gln自發(fā)降解產(chǎn)生的銨,限制培養基中Gln的添加濃度可以降銨的積累,另外可以用更為穩定的Gln派生物代替以減少其自發(fā)降解量,如甘氨酰谷氨酰胺。
 
大多數情況下,銨主要來(lái)源于谷氨酰胺酶作用下Gln轉化成谷氨酸(Glu)的過(guò)程,Gln自發(fā)降解產(chǎn)生的銨只占極少一部分。如果將Glu,而不是Gln添加到培養基中便可有效的減少銨的生成,但同時(shí)也會(huì )在一定程度下降低細胞的生長(cháng)速率。與Glu的出發(fā)點(diǎn)類(lèi)似,其他氨基酸的添加也可降低銨的積累。Chen等進(jìn)行了相關(guān)的研究,其通過(guò)外源性添加10mMNH4Cl到培養基模擬高濃度銨離子,并在此條件下測定了不同種氨基酸對細胞生長(cháng)的影響。實(shí)驗得出蘇氨酸(threonine)、脯氨酸(proline)和甘氨酸(glycine)可以抑制高濃度銨對細胞的毒性,與對照相比,分別使細胞終密度提高了15%、20%和25%,如圖5所示,其中絲氨酸(alanine)的添加作用負對照。對添加銨的實(shí)驗組中對照組與蘇氨酸、脯氨酸和甘氨酸實(shí)驗組的代謝參數比較,發(fā)現氨基酸組的銨濃度要比對照組低,同時(shí)其谷氨酰胺濃度也要高些,而葡萄糖消耗和乳酸生成均要低些,這就說(shuō)明三種氨基酸的添加促進(jìn)了細胞的碳代謝與氮循環(huán),從而促進(jìn)細胞生長(cháng)。
 
優(yōu)化細胞培養策略也可以降低銨的累積,例如對谷氨酰胺和葡萄糖的補料方式及補量進(jìn)行優(yōu)化,以其他糖類(lèi)代替葡萄糖,如半乳糖、甘露糖、果糖等,主要是通過(guò)對細胞代謝路徑的調控來(lái)減少銨累積。采用物理移除培養系統中的銨也是一種選擇,例如透氣型、疏水多孔膜,離子交換膜或離子交換樹(shù)脂和電滲析等方法,然而這些方法只有應用于產(chǎn)生大量銨離子的高密度細胞培養中才能體現對活細胞密度和抗體濃度的改善。
 
細胞培養時(shí)代謝廢物銨的累積不僅會(huì )影響細胞的表現,還會(huì )對抗體的糖基化產(chǎn)生影響,追問(wèn)其機理可能與細胞胞內的pH平衡破壞與酶活下降有關(guān)。但是,對谷氨酰胺和葡萄糖的補料策略進(jìn)行優(yōu)化,或者采用其他氨基酸代替谷氨酰胺等均可控制銨的累積。
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