探討PAX1基因甲基化定量檢測在宮頸癌癌前病變診斷中的應用價(jià)值。

　　方法選取2013年1月至2015年10月就診于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫院的121例高危亞型人乳頭狀瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）感染患者為研究對象。根據病理學(xué)結果將其分為正常宮頸組（28例）、低級別病變組[宮頸上皮內瘤變（cervicalintraepi-thelialneoplasia，CIN）Ⅰ，32例]、高級別病變組（CINⅡ～Ⅲ，34例）及癌變組[浸潤性宮頸癌（invasivecervicalcancers，ICC），27例]。收集各組患者的宮頸組織標本及宮頸刮片，采用反轉錄聚合酶鏈反應和焦磷酸測序技術(shù)定量分析PAX1基因9個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平，并通過(guò)接受者操作特征曲線(xiàn)（ROC曲線(xiàn)）計算PAX1甲基化與各級別宮頸病變的關(guān)聯(lián)性。

　　結果癌變組、高級別病變組、低級別病變組、正常宮頸組PAX1基因9個(gè)位點(diǎn)的甲基化平均水平分別為4.66%、3.55%、2.10%、1.90%，組間比較差異均具有顯著(zhù)性（P＜0.05）。各組患者宮頸刮片和宮頸組織PAX1甲基化水平比較差異均具有顯著(zhù)性（P＜0.01），其中，癌變組PAX1甲基化發(fā)生率及水平均顯著(zhù)高于其他三組（P＜0.05）。通過(guò)PAX1基因甲基化水平鑒別診斷宮頸癌和CIN，結果顯示其ROC曲線(xiàn)下面積為0.88（P＜0.001），具有較高的診斷能力。

　　關(guān)鍵詞：宮頸癌癌前病變；焦磷酸測序；PAX1；甲基化

　　研究資料表明，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率正逐年上升，已分別居女性惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的第3位和第4位[1]。研究顯示，我國宮頸癌每年的新發(fā)病例數由2010年的2.85萬(wàn)～13.75萬(wàn)上升為2015年的4.58萬(wàn)～18.85萬(wàn)[2]。人乳頭狀瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）的持續性與反復性感染是宮頸癌最常見(jiàn)的病因之一[3]。研究表明，PAX1基因的異常甲基化表達升高，可在多個(gè)不同階段及層次上影響宮頸癌及癌前病變的病理進(jìn)程，與宮頸癌的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)[4，5]。本研究基于反轉錄聚合酶鏈反應（reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR）技術(shù)及焦磷酸測序技術(shù)，定量分析正常宮頸、低級別病變宮頸、高級別病變宮頸以及患癌宮頸的細胞及組織刮片中PAX1基因的甲基化水平，定量檢測目的基因的甲基化水平，以明確其在區分各級宮頸病變中的臨床應用價(jià)

　　值，現報道如下。

　　1、資料與方法

　　1.1、一般資料

　　選取2013年1月至2015年10月就診于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫院的121例高危型HPV感染患者為研究對象。排除婦科良/惡性腫瘤病史、妊娠、免疫及造血系統疾病相關(guān)病史患者。所有研究對象均簽署知情同意書(shū)。121例患者依據病理分級不同分為正常宮頸組（28例）、低級別病變組[宮頸上皮內瘤變（cervicalintraepi-thelialneoplasia，CIN）Ⅰ，32例]、高級別病變組（CINⅡ～Ⅲ，34例）及癌變組[浸潤性宮頸癌（invasivecervicalcancers，ICC），27例]。正常宮頸組患者平均年齡為（35.26±7.14）歲，HPVDNA定量為（367.35±105.72）mg/ml；低級別病變組患者平均年齡為（38.45±7.45）歲，HPVDNA定量為（492.74±142.91）mg/ml；高級別病變組患者平均年齡為（38.78±7.26）歲，HPVDNA定量為（613.65±186.21）mg/ml；癌變組患者平均年齡為（37.28±2.15）歲，HPVDNA定量為（376.74±114.24）mg/ml。四組患者一般資料比較差異均無(wú)顯著(zhù)性，具有可比性（P＞0.05）。

　　1.2、方法

　　1.2.1、宮頸標本采集與保存

　　患者取截石位，常規消毒鋪巾，取少量宮頸病變部位的細胞制成宮頸刮片，陰道鏡下鉗取少量宮頸組織進(jìn)行病理活檢，并行HPV檢查，4℃保存待用。研究時(shí)行宮頸組織活檢，并收集宮頸刮片進(jìn)行PAX1基因的甲基化檢測。上述各組檢測結果最終以病理學(xué)檢查結果作為參照。

　　1.2.2、宮頸DNA提取、化學(xué)修飾與擴增

　　參照德國Qiagen公司生產(chǎn)的試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取DNA與亞硫酸氫鹽DNA后處理，然后進(jìn)行PAX1基因轉錄。PAX1基因外側上游引物：5'-AAGTTGATTTAGGGTTTGGGGT-3'；外側下游引物：5'-ACCCAGCTCATCCACACTCCC-3'。PAX1基因上游引物：5'-GTGGAGACTGTGTCGGGAGGG-3'，下游引物：5'-AAATACCCRAGACTAAACGC-3'。采用生物素

　　標記下游引物5'末端。

　　1.2.3、焦磷酸DNA測序

　　參照焦磷酸測序儀（PyroMarkQ96ID焦磷酸測序儀，美國）中甲基化分析相關(guān)要求，首先制備單鏈DNA模板，然后進(jìn)行焦磷酸測序。目的基因所用引物：5'-GGAGGTAGGTTTTGGAG-3'，可測得PAX1基因有9個(gè)胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤島（cytosine-phosphoricacidguanine，CpGisland）。獲得PAX1基因測序結果后，以單個(gè)基因所有檢測位點(diǎn)的甲基化率的平均值表示每組樣本的基因甲基化水平。經(jīng)焦磷酸測序技術(shù)，對相關(guān)目的基因的9個(gè)不同位點(diǎn)進(jìn)行甲基化定量測試分析。以試劑盒提供的通用DNA作為內參。不同位點(diǎn)檢測標本中，某單一位點(diǎn)的甲基化水平與內參中該位點(diǎn)的甲基化水平的比值，用以表示該位點(diǎn)的甲基化發(fā)生率。

　　1.3、統計學(xué)方法

　　所有統計學(xué)數據均由SPSS17.0軟件處理。計量資料以x±s表示，比較采用t檢驗；計數資料以%表示，比較采用χ2檢驗；繪制不同組別的接受者操作特征曲線(xiàn)（ROC曲線(xiàn)），通常以ROC曲線(xiàn)下面積進(jìn)行比較。相關(guān)性研究使用散點(diǎn)圖形式。檢驗水準為α＝0.05，P＜0.05表示差異有顯著(zhù)性。

　　2、結果

　　2.1、宮頸組織PAX1基因甲基化的定量分析

　　正常宮頸組、低級別病變組、高級別病變組、癌變組患者病變組織中PAX1基因相關(guān)位點(diǎn)甲基化水平分別為1.90%、2.10%、3.55%、4.66%，各組組間比較差異均具有顯著(zhù)性（P＜0.05）。

　　2.2、四組患者病變組織中PAX1基因甲基化水平的定量分析

　　四組患者病變組織中PAX1基因甲基化發(fā)生率和HPV陽(yáng)性率比較差異均具有顯著(zhù)性（P＜0.05）（表1）。各組患者宮頸刮片和宮頸組織PAX1基因甲基化水平組間兩兩比較差異均具有顯著(zhù)性（P＜0.05）（表2），且癌變組患者宮頸刮片和宮頸組織PAX1基因甲基化水平顯著(zhù)高于其他三組（P＜0.05）。宮頸刮片與癌變組織PAX1基因甲基化之間的相關(guān)性分析見(jiàn)圖1，r≥0.80表示宮頸刮片與癌變組織PAX1甲基化水平具有相關(guān)性（P＜0.05）。

　　2.3、PAX1基因甲基化水平診斷宮頸癌和CIN的相關(guān)性分析

　　3、討論

　　臨床上，從宮頸癌前病變發(fā)展至宮頸癌大多需要數年甚至幾十年的時(shí)間。宮頸癌早期癥狀多不明顯，待癥狀明顯、惡性程度加劇時(shí)往往已屬疾病的中晚期。因此，研究宮頸癌的發(fā)病機制，尋找有助于臨床診斷和治療的有效分子標志物對提高宮頸癌患者的生存率具有重要意義[6]。既往研究結果顯示，宮頸癌變過(guò)程包括諸多基因及表觀(guān)與調控基因的改變[4]，其中最重要的是以DNA甲基化為代表的表觀(guān)遺傳學(xué)改變，該過(guò)程主要表現為腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子區域發(fā)生異常，導致目的基因及調控基因的轉錄失活，進(jìn)而促使腫瘤的發(fā)生及發(fā)展；65%～95%的宮頸癌組織及細胞中可檢測到DNA甲基化。因此，在宮頸脫落細胞及宮頸組織活檢中，將基因甲基化作為一項檢測指標有助于實(shí)現宮頸癌的早期診斷。

　　隨著(zhù)診斷技術(shù)的發(fā)展以及細胞學(xué)檢查等技術(shù)的推廣及普及，HPV病毒微量提取[7,8]與雜交法[9]的廣泛應用，已使多種類(lèi)型的宮頸癌前病變及早期浸潤性宮頸癌得到診治。統計分析表明，感染HPV者并不一定會(huì )發(fā)生癌前病變或宮頸癌，這提示在宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中，可能存在其他協(xié)同因子的共同促進(jìn)效應?；诨蚝偷鞍姿降奶禺愋詸z測方法應運而生。多項研究證實(shí)，癌基因的異常表達在多方面影響腫瘤的發(fā)生及發(fā)展（如細胞增殖與分裂的調控）；抑癌基因的異常甲基化（調控失調）亦可抑制抑癌基因的表達與下游基因的調控[10]。已有研究顯示PAX1基因甲基化水平在宮頸癌組織中異常增高，并與啟動(dòng)子的甲基化相關(guān)，且PAX1基因甲基化可在宮頸癌患者的脫落細胞中被檢測到[11-13]。還有研究顯示，PAX1基因甲基化陽(yáng)性率與宮頸癌的病理分級和淋巴轉移等關(guān)系密切，因此PAX1基因有望成為宮頸癌早期診斷的分子標志物[14-19]。目前多數研究?jì)H關(guān)注PAX1基因甲基化狀態(tài)的定性檢測，還難以進(jìn)行精確地量化判斷與評價(jià)。

　　既往研究發(fā)現，PAX1基因甲基化水平對宮頸癌的診斷有一定的幫助。Kim等[12]研究發(fā)現，PAX1基因甲基化檢測可明顯提高宮頸脫落細胞及活檢組織檢測的準確性，并且可替代50%的陰道鏡檢查和宮頸組織活檢。Nikolaidis等[20]指出PAX1基因甲基化水平可作為宮頸癌早期診斷的一種輔助手段，其區分CIN2與正常組織的靈敏度與特異度分別為0.66和0.92；此外，PAX1基因甲基化的水平區分CIN3與正常組織的靈敏度與特異度分別為0.77和0.92，與其相對應的ROC曲線(xiàn)下面積分別為0.923和0.931，具有較高的診斷價(jià)值。

　　但既往研究未對患病類(lèi)型進(jìn)行區別診斷。本研究使用更為敏感而特異性強的定量分析方法，結果顯示，癌變組PAX1基因甲基化發(fā)生率顯著(zhù)高于其他三組；宮頸刮片和宮頸組織中PAX1基因甲基化水平在各組之間差異均具有顯著(zhù)性，且癌變組患者PAX1基因甲基化水平顯著(zhù)高于其他三組。上述結果提示：通過(guò)PAX1基因甲基化發(fā)生率及其定量水平的測定，可以在一定程度上對宮頸癌高危人群進(jìn)行篩選，并為后期定期隨訪(fǎng)觀(guān)察提供依據。此外，本研究通過(guò)對PAX1基因甲基化水平鑒別診斷不同癌前病變人群與宮頸癌患者，結果發(fā)現其ROC曲線(xiàn)下面積為0.88，具有較高的診斷鑒別能力。當其在最佳閾值下，分析PAX1基因甲基化水平檢測癌前病變與宮頸癌的靈敏度明顯優(yōu)于傳統的宮頸脫落細胞形態(tài)學(xué)檢測。本研究結果能夠解決臨床上基于PAX1基因甲基化的部分患者的診療問(wèn)題，為臨床治療提供參考依據。

　　綜上所述，定量檢測宮頸組織細胞中的PAX1基因甲基化水平，用以診斷宮頸癌前病變具有臨床應用價(jià)值。